想了解哪些食品易受蠟樣芽孢桿菌的污染嗎？想知曉國(guó)內(nèi)外關(guān)于蠟樣芽孢桿菌的限量標(biāo)準(zhǔn)嗎？想掌握蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)--蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶的染色方法嗎？這篇文章會(huì)給你想要的答案。

蠟樣芽孢桿菌簡(jiǎn)介

?????蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是芽孢桿菌屬的一員，為兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，廣泛存在于土壤、塵埃、空氣和植物等自然環(huán)境中。

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)易受蠟樣芽孢桿菌污染的食品包括米飯或淀粉類制品、乳制品、水果制品等。值得注意的是，該菌污染的食物在感官上無明顯變化，不易被察覺，當(dāng)在食物中大量繁殖產(chǎn)生腸毒素被誤食時(shí)會(huì)引起食物中毒，表現(xiàn)為惡心嘔吐或腹痛腹瀉。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)1973-2013年的食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件占比12.95%，位居第二。

在日常飲食中為了保障食品安全，在室溫較高時(shí)，米飯及淀粉制品應(yīng)選擇冷藏保存，避免蠟樣芽孢桿菌的繁殖。此外，生食的蔬菜和水果應(yīng)認(rèn)真清洗后食用。

蠟樣芽孢桿菌的限量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)?

目前，我國(guó)大陸地區(qū)缺乏即食食品中蠟樣芽孢桿菌的限量標(biāo)準(zhǔn)。下表列出其他國(guó)家、中國(guó)香港和澳門地區(qū)的限量要求，希望為您制定產(chǎn)品的限量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)依據(jù)。澳大利亞和新西蘭標(biāo)準(zhǔn)可接受水平為10²~10³?CFU/g，英國(guó)和中國(guó)香港標(biāo)準(zhǔn)可接受水平為10³~10⁵CFU/g，中國(guó)澳門標(biāo)準(zhǔn)可接受水平為10³~10⁴?CFU/g。

我國(guó)食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)依照標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.14-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》進(jìn)行，包括平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法，主要檢驗(yàn)步驟為樣品稀釋、接種、分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)、染色鏡檢和生化鑒定。

有文獻(xiàn)報(bào)道稱，蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）和炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）具有高度的DNA同源性，共同構(gòu)成了蠟樣芽孢桿菌群（Bacillus cereus?group species），在形態(tài)學(xué)和生理生化反應(yīng)方面極其相似，如此便為蠟樣芽孢桿菌的鑒定帶來了難度。

無論選擇生化鑒定試劑盒還是全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（如VITECK-2）進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌的鑒定，若要區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽胞桿菌，均需進(jìn)行蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)。產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素晶體是蘇云金芽孢桿菌區(qū)別其他芽孢桿菌的重要依據(jù)。蘇云金芽孢桿菌是當(dāng)前研究最為深入、應(yīng)用最為廣泛的微生物農(nóng)藥，其殺蟲的機(jī)理就在于芽孢形成期產(chǎn)生的具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶，昆蟲食入后，引起腸道細(xì)胞發(fā)生腫脹或自溶，導(dǎo)致蟲體死亡。

蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色方法?

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接下來就是介紹蛋白毒素結(jié)晶染色方法和心得體會(huì)的時(shí)候了。

01?菌株的培養(yǎng)

將待鑒定菌株接種于硫酸錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，30?℃±1?℃培養(yǎng)24 h±2 h。

02?室溫放置

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將培養(yǎng)物于室溫放置3 d~4 d，待芽孢和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶的形成。若染色發(fā)現(xiàn)游離芽孢形成的不豐富，可繼續(xù)放置2 d~3 d再染色鏡檢。

將培養(yǎng)物逐天染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，放置至D5時(shí)，觀察到游離芽孢和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶，但不豐富，需切換視野進(jìn)行尋找。隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶逐漸豐富。直到放置至D10，視野中布滿了蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶。不同菌株間在芽孢和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶形成時(shí)間上存在差異。

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03?染色

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A? 挑取少量培養(yǎng)物于載玻片上，滴加一滴蒸餾水混勻并涂成薄膜（同革蘭氏染色）。

B? 經(jīng)自然干燥，微火固定（同革蘭氏染色）。

C? 加甲醇作用30 s后傾去，再通過火焰干燥。

D? 于載玻片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅，用鑷子夾取載玻片放于酒精燈火焰上加熱1 min～2 min。

控制好載玻片與火焰的距離，以達(dá)到“微見蒸汽，勿使染液沸騰”的效果。若加熱過度，染液干涸在載玻片上，后續(xù)難以徹底清洗，不利于鏡檢觀察。嘗試滴加染液后于室溫放置30 min，染色效果滿意，若把握不好加熱效果，此方法值得一試。

E? 傾倒染液，更換染液后再次加溫30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干。

04?鏡檢

鏡檢觀察有無游離芽孢（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶。除蘇云金芽孢桿菌外，其他芽孢桿菌不產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶。下圖中紅色箭頭標(biāo)記為蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶，藍(lán)色箭頭標(biāo)記為游離芽胞，黃色箭頭標(biāo)記為菌體。

蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色鏡檢（放置5天和10天）

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